Utvrđivanje optimalnih uvjeta za određivanje katalitičke aktivnosti ekto-ATPaze u serumu čovjeka

diplomski rad

• Naslov (engleski): Optimization of the method for determination of the catalytic activity of ecto-ATPase in human blood serum
• Autor: Diana Salem
• Mentor: Tihana Žanić Grubišić (mentor)
• Član povjerenstva: Tihana Žanić Grubišić
• Član povjerenstva: Anita Somborac Bačura
• Član povjerenstva: Lovorka Vujić
• Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Sveučilište u Zagrebu; Farmaceutsko-biokemijski fakultet; (Zavod za medicinsku biokemiju i hematologiju); Zagreb
• Datum i država obrane: 2015-09-25, Hrvatska
• Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana: BIOMEDICINA I ZDRAVSTVO; Farmacija; Farmacija

Sažetak

Ekstracelularni ATP aktivira ionotropne P2X receptore i metabotropne P2Y receptore i time inicira brojne stanične odgovore. Ekto-ATPaza je enzim koji hidrolizira vanstanični ATP te je stoga bitna u regulaciji aktivacije P2 receptora i održavanju homeostaze. Nukleozid trifosfat difosfohidrolazna obitelj (NTPDaza) uključuje osam različitih članova. NTPDaze1, 2, 3 i 8 su dominantne ektonukleotidaze koje su lokalizirane na površini stanične membrane. Topljive forme humane NTPDaze se sastoje samo od ekstracelularne domene te je primijećena njihova smanjena sposobnost hidrolize nukleotida u usporedbi s NTPDazama koje se nalaze na staničnoj membrani, a koje sadrže dvije transmembranske domene. Za aktivnost NTPDaze zahtijevaju dvovalentne katione, Mg2. ione ili Ca2. ione s optimalnom koncentracijom između 1 i 5 mM te su aktivne u fiziološkom do blago alkalnom pH mediju (7,0-8,5). Svrha ovog istraživanja je bila optimirati metodu za određivanje katalitičke aktivnosti ekto-ATPaze u serumu čovjeka. Za deproteinizaciju u probama uzorka optimalnom se pokazala 3,0 M TCA, a za deproteinizaciju u slijepim probama uzorka optimalnom se pokazala 1,1 M TCA. Također je pokazano da razlika u molaritetu TCA ne utječe na apsorbanciju razriješenih standarda kalijevog dihidrogenfosfata. Katalitička aktivnost ekto-ATPaze je određivana u uzorcima seruma zdravih osoba, pri čemu je mjerena koncentracija oslobođenog fosfata nastalog hidrolizom 3 mM ATP-a, spektrofotometrijski na 620 nm i 830 nm, te je razdioba aktivnosti ispitana Kolmogorov-Smirnovim testom na 620 nm normalna. Na uzorku od 17 zdravih ispitanika ustanovljeno je da srednja vrijednost aktivnosti ektoATPaze iznosi 1,20 } 0,69 ƒĘmol/L/min.

Sažetak (engleski)

Extracellular ATP activates ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors and initiates multiple cellular response. Ecto-ATPase is an enzyme whose role is hydrolysis of extracellular ATP, thus this enzyme has an important role in regulation and activation of P2 receptors and maintenance of homeostasis. Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family comprise of eight different members with four of the NTPDases (NTPDase1, 2, 3 and 8) being expressed as cell surface-located enzymes. Soluble forms of human NTPDases comprise of only extracellular domains and the nucleotide-hydrolyzing capabillities of these soluble enzymes were diminished in comparison with membrane-embedded NTPDases containing two transmembrane domains. For their activity NTPDases require Mg²⁺ or Ca²⁺ ions with optimal concentration between 1-5 mM and they are active in physiological to slightly basic pH range (7.0-8.5). The aim of this study was to optimize the method for determination of the catalytic activity of ecto-ATPase in human serum. The results showed that 3.0 M TCA is optimal for deproteinization in probe, and 1.1 M TCA is optimal for deproteinization in blind probe. Also it has been shown that the difference in molarity of TCA does not effect on absorbance of diluted standards. Catalytic activity of ecto-ATPase was determined in blood serum samples, where the absorbance of realsed phosphate, developed by hydrolysis of 3 mM ATP, was measured by spectrofotometar on two wavelength 620 and 830 nm, and distribution of activity tested by Kolmogorov-Smirnov test for 620 nm was normal. The mean of ecto-ATPase activity, for 17 serum blood samples, was 1.20 ± 0.69 μmol/L/min.

• Ključne riječi: ekto-ATPaza; NTPDaze; ektonukleotidaze; ekstracelularni ATP; purinska signalizacija; optimizacija metode; krvni serum
• Ključne riječi (engleski): ecto-ATPase; NTPDase; ectonucleotidase; extracellular ATP; purinergic signaling; optimization of the method; blood serum
• Jezik: hrvatski
• URN:NBN: urn:nbn:hr:163:501907
• Studijski program: Naziv: Farmacija; Vrsta studija: sveučilišni; Stupanj studija: integrirani preddiplomski i diplomski; Akademski / stručni naziv: magistar/magistra farmacije (mag. pharm.)
• Vrsta resursa: Tekst
• Način izrade datoteke: Izvorno digitalna
• Prava pristupa: Otvoreni pristup
• Datum i vrijeme pohrane: 2016-02-25 12:39:19